Western blotting

Western blot (имуноблот) : Гел-електрофореза на протеини

Western blotting или имуноблотинг е аналитична техника, използвана в клетъчната и молекулярната биология за идентифициране на специфични протеини в сложна смес от протеини, като тези, присъстващи в клетъчни или тъканни екстракти. Техниката използва три стъпки за постигане на това: разделяне по размер, прехвърляне в твърда среда и накрая визуализация.чрез протеиново маркиране с използване на подходящи първични или вторични антитела .

Western blot Какво открива?

Western blotting е лабораторна техника, използвана за откриване на специфичен протеин в кръвна или тъканна проба. Методът включва използването на гел електрофореза за отделяне на протеини от пробата. Отделените протеини се прехвърлят от гела към повърхността на мембраната. Мембраната е изложена на специфично антитяло срещу изследвания протеин. Свързването на антитялото се открива с помощта на радиоактивен или химичен маркер. Western Blot понякога се използва за диагностициране на заболяване.

Western blot (Immunoblot) :гел електрофореза на протеини

Western блотирането (наричано още имуноблотинг) е техника, използвана за анализ на отделни протеини в смес от протеини (напр. клетъчен лизат).

При Western blotting (imunoblot) протеиновата смес се прилага към гел електрофореза върху носеща матрица (SDS-PAGE, естествена PAGE, изоелектрично фокусиране, 2D гел електрофореза и т.н.), за да се сортират протеините по размер, заряд или други разлики в отделни протеинови ленти.

След това отделените протеинови ленти се прехвърлят към носеща мембрана (напр. нитроцелулоза, найлон или PVDF). Този процес се нарича блотиране. Протеините се придържат към мембраната по същия модел, по който са били разделени поради взаимодействия на заряда.

След това протеините в този имуноблот са достъпни за свързване с антитела за откриване.

Антителата се използват за откриване на целеви протеини в Western blot (имуноблотинг). Антителата се конюгират с флуоресцентни или радиоактивни етикети или ензими, които предизвикват последваща реакция с приложен реагент, което води до оцветяване или излъчване на светлина, което позволява откриване.

Терминът Western Blotting се основава на игра на думи. Southern blotting, който е метод за откриване на специфични ДНК последователности, е кръстен на Ed Southern, който е първият, който описва тази процедура.

Уестърн блот (имуноблот), както и нозерн блот (за откриване на РНК), играят върху значението на това име.

Western blot Гел-електрофореза

Какво представлява протеиновата гел-електрофореза?

гел електрофорезата е техника, използвана за разделяне на фрагменти от ДНК (или други макромолекули, като РНК и протеини) по размер и заряд. Електрофорезата включва прилагане на ток през гел, съдържащ интересуващите ни молекули. В зависимост от техния размер и заряд, молекулите ще се движат през гела в различни посоки или с различни скорости, като по този начин ще ги разделят една от друга.

  • Гел електрофорезата е техника, използвана за разделяне на ДНК фрагменти според техния размер.
  • ДНК проби се зареждат в ямки (слотове) в единия край на гела и се прилага електрически ток, за да ги изтегли през гела.
  • Фрагментите са отрицателно заредени, така че се движат към положителния електрод. Тъй като всички ДНК фрагменти имат еднакво количество заряд на маса, по-малките фрагменти преминават през гела по-бързо от по-големите.
  • Когато гелът е оцветен с пигмент, който се свързва с ДНК, ДНК фрагментите могат да се видят като ленти, които представляват група от ДНК фрагменти с еднакъв размер.

Различни видове гел електрофореза на протеини

Могат да бъдат избрани различни видове гел електрофореза за протеини в зависимост от критериите, по които трябва да се разделят протеините. Някои често използвани електрофоретични методи са: SDS-PAGE, native-PAGE и изоелектрично фокусиране.

SDS-PAGE:
Родна СТРАНИЦА:

С този метод могат да се разделят естествени, ненагънати и неденатурирани протеини. Този метод позволява разделянето на протеини, които са недостъпни с други методи. Пример би бил разделянето на модифицирани и немодифицирани протеини от един и същи тип (напр. фосфорилирано спрямо нефосфорилирано състояние на протеин). Нативният PAGE може също да се използва за потвърждаване на биологично значими конформации, като ди-, три- или тетрамерни форми на протеини (за разлика от SDS-PAGE, който би разделил отделни, денатурирани пептидни вериги). Този метод може също да открие различни комплекси от различни протеини.

Разделянето чрез “Native PAGE” зависи от редица параметри като заряд, размер и 3D структура на протеина. Необходим е подходящ буфер за поддържане на 3D нагъването на протеина. Приложимостта на буфера зависи от изоелектричната точка и протеиновите натоварвания.

Изоелектричен фокус:

Този метод се основава на факта, че протеинът има специфичен заряд при определени стойности на pH. В зависимост от pH, киселинните и основните функционални групи допринасят за увеличаване или намаляване на общия заряд на протеина. Изоелектричната точка се определя като точката, в която общият заряд на молекулата е нула, тъй като има еднакво количество отрицателни и положителни заряди върху молекулата.

Необходими са специални градиентни гелове за изоелектрично фокусиране, тъй като pH се променя от киселинно към основно по протежение на градиента в гела. Благодарение на електрически заряд, прикрепен към гела, протеинът се придвижва до точката в гела, където зарядът на гела е равен на този на протеина, а общият заряд е равен на нула, т.е. изоелектричната точка. Следователно този метод се използва за разделяне на протеини по техните заряди, както и за определяне на изоелектричната точка на целевия протеин. Разделянето става чрез заряда на протеина или чрез броя на основните и киселинните групи, съдържащи се в протеина.

Горните методи за електрофореза на протеинов гел могат също да се комбинират за разделяне на протеини. Изборът на методи зависи от специфичните изисквания на експеримента.

Попиване

След отделяне на протеиновата смес, полипептидните ленти се прехвърлят върху мембранна опора. За целта мембраната се залепва към гела и този така наречен сандвич се пренася в камера за електрофореза. Възможно е част от SDS да бъде отстранена и протеинът да бъде частично повторно наситен, т.е. да възвърне своята 2D и 3D структура. Приложеният електрически заряд обаче кара протеините да излизат от гела вертикално в посоката, в която са се движили в гела, върху мембраната. По този начин протеиновите ленти се свързват с мембраната. „Изтритите“ ленти вече са достъпни за допълнителна обработка (напр. за откриване на специфични протеини със специфични антитела).

Имунодетекция

Идентифицирането на специфични антитела е възможно след разделяне и блотинг на протеините. Специфични антитела (моноклонални или поликлонални) се свързват с “тяхната” протеинова лента. Неспецифичните свързващи антитела се отстраняват чрез промиване с буфери, съдържащи детергенти. В допълнение, неспецифичните свързващи джобове могат да бъдат блокирани, преди да се добавят специфични антитела.

Обикновено първо се прилагат първични антитела, които след това се разпознават от вторично антитяло. Вторичното антитяло се конюгира с цвят, радиоактивност или ензим за откриване. За тази цел се използват и биотин-конюгирани антитела.

Защо Western Blot (Immunoblot) е важен?

Методът Western blot (imunoblot) има няколко предимства в сравнение с други имуносорбентни анализи (ISA), като ELISA.

Western blotting (имуноблотинг) разширява идеята за ELISA, като позволява разделянето на протеиновата смес по размер, заряд и/или конформация. Описаният метод на отстраняване позволява откриването на няколко мишени, за разлика от ELISA, където може да бъде открит само един протеин.

Тъй като електрофорезата с протеинов гел разделя протеините на ленти, може да се определи размерът на целевия протеин/полипептид. Също така е възможно да се (полу-)количествено определи интересуващият се протеин чрез пускане на вътрешен количествен стандарт успоредно с пробите върху гела.

Съдържанието на протеин в пробите също може да бъде сравнено („проба А съдържа повече протеин от проба Б“).

Недостатък на Western blot (imunoblot) е, че отнема време (в сравнение с ELISA) и има голямо търсене от гледна точка на експертизата на експериментатора.

В допълнение, това изисква оптимизиране на експерименталните условия (т.е. изолиране на протеини, буфери, тип на разделяне, концентрация на гел и т.н.).

Има много различни видове и методи на Western blotting (имуноблотинг). Следователно, той обхваща много различни теми и приложения.

Прочетете повече в нашия блог