Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) е мощен метод за откриване и количествено определяне на специфичен протеин в сложна смес. Първоначално описан от Engvall и Perlmann (1971), методът позволява анализ на протеинови проби, имобилизирани в ямки на микроплака, като се използват специфични антитела.

ELISA обикновено се извършват в 96- или 384-ямкови полистиренови плаки, които пасивно свързват антитела и протеини. Това свързване и обездвижване на реагентите е това, което прави ELISA лесен за проектиране и изпълнение.

Имобилизирането на ELISA реагентите върху повърхността на микроплаката улеснява разделянето на свързания и несвързания материал по време на анализа. Тази способност за използване на антитела с висок афинитет и за измиване на неспецифично свързани материали прави ELISA мощен инструмент за измерване на специфични аналити в суров препарат.

Тестът ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ) е тест, който открива и измерва антитела в кръвта и може да се използва за определяне дали пациентът има антитела, свързани с определени инфекциозни заболявания.

Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA) е метод за изследване, базиран на антитела. Тази широко използвана технология е чувствителна, бърза и надеждна.

Антителата са протеини, които тялото произвежда в отговор на вредни вещества (наречени антигени). Използва се в много лаборатории, за да се определи дали антитело има в кръвната проба на пациент. Въпреки че процедурата е рутинна и проста, тя включва голям брой променливи, като избор на реагент, температура, измерване на обема и време, които, ако не са коригирани правилно, могат да повлияят на последователните стъпки и резултата от теста.

Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ (ELISA), известен също като ензимен имуноанализ (EIA), е биохимична техника, използвана предимно в имунологията за откриване на наличието на антитяло или антиген в проба. ELISA се използва като диагностичен инструмент в медицината и растителната патология, както и за контрол на качеството в различни индустрии, като приложение в хранително-вкусовата промишленост.

Техниката е предложена като алтернатива на радиоимуноанализа, тъй като последният представлява риск за здравето поради използваните радиоактивни изотопи.

Тази техника се различава от другите, базирани на реакцията Ag-Ac, по това, че свързването към твърда повърхност позволява идентифицирането на специфични реакции и следователно получаването на количествени резултати.

Методът ELISA е еталон за количествено определяне на патологични антигени и всъщност съществуват много вариации на този метод. Те са подходящи за скрининг с висока производителност, тъй като резултатите са бързи, последователни и сравнително лесни за анализ.

Най-добрите резултати са получени с формата на сандвич, като се използват високо пречистени, предварително съчетани антитела за улавяне и детектор. Полученият сигнал предоставя много чувствителни и много специфични данни.

Антителата са протеини, произведени в плазмени клетки на гръбначни като част от адаптивната имунна система срещу структури (антигени), които тялото разпознава като чужди елементи.

Антителата се свързват със съответните антигени, използвайки различен модел на йонни и хидрофобни взаимодействия, водородни мостови връзки и сили на Ван-дер-Ваалс. Взаимодействието между антитялото и съответния антиген е селективно и силно специфично, подобно на това на ключалката.

Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ се основава на това селективно и специфично разпознаване на антитяло-антиген. Установени са много качествени и количествени формати за ELISA анализ.

Изпълнението на ELISA анализ изисква поне едно антитяло, специфично за определен антиген. Съгласно основния метод един от имунологичните компоненти се имобилизира върху твърда фаза в кухините на микротитърната плака. Аналитът на пробата взаимодейства със системата антитяло-антиген. Това взаимодействие може да се визуализира от ензими, свързани с антигени или вторични антитела, и показва дали е настъпило свързване антиген-антитяло. Свързаният ензим преобразува добавения субстрат, което води до промяна на цвета, която може да бъде измерена със спектрофотометър.

Експериментът ELISA започва с етапа на имобилизиране на антигена на дадена проба в ямките на многоямкова плака. Процесът на обездвижване може да бъде постигнат чрез два метода, включително директна адсорбция към повърхността на плоча или чрез сонда за улавяне на антитяло, адсорбирана върху плочата. Сондата за антитяло трябва да бъде силно специфична към антигена, който представлява интерес. Имобилизирането е последвано от добавяне на антитялото за откриване, което води до комплекс антиген-антитяло. Антитялото, приложимо за откриване, обикновено се маркира чрез използване на ензими като алкална фосфатаза (АР) или пероксидаза от хрян (HRP).

ELISA могат да бъдат класифицирани в четири основни категории, а именно директни, индиректни, сандвич и конкурентни, в зависимост от модификациите, направени в основните процедури. Сандвич ELISA е най-мощният формат ELISA поради високата си чувствителност и устойчивост. Изборът на субстрат за анализа зависи от необходимата чувствителност, вида на необходимата апаратура и нейната наличност.

Плаките за ELISA се приготвят чрез покриване на ямките с разтворите, в които се предполага, че присъства антигенът. Те се инкубират с белязани антитела. Те показват наличието на антиген в тествания разтвор.

Необходимо е да се включат отрицателни контроли, които представляват проби от същия тип като анализираните (кръв, урина и др.), но при които е сигурно отсъствието на търсения антиген. Включени са и положителните контроли (разтвори, в които се намира търсеният антиген).

• Бързо и с минимални процедурни стъпки.
• Минималното изискване за прекурсор го прави по-малко податлив на грешки.

• Имобилизацията на антигена не е специфична, така че се наблюдават свързани с фона проблеми..
• Предлага по-малка гъвкавост по отношение на първичното антитяло.
• Липсата на усилване на сигнала намалява чувствителността.

Плаките ELISA се приготвят по същия начин, както по-горе. Положителните и отрицателните контроли са еднакви. Системата за откриване използва две антитела: първично антитяло срещу антигена и вторично антитяло, белязано срещу първичния антиген.

Откриването е по-чувствително поради усилването на сигнала поради свързването на две или повече вторични антитела към всяко първично. Това е най-популярният анализ, както и индиректната имунофлуоресценция, тъй като една и съща вторично белязана и ензимна система позволява количественото определяне на голямо разнообразие от антигени; следователно е по-гъвкав и по-евтин метод, въпреки че губи известна прецизност, като има допълнителна връзка в сравнение с директния метод.

Разреждането на разтвора, съдържащ първичното антитяло – напр. кръвен серум – е много важен фактор, който трябва да се вземе предвид, за да се избегнат фалшиви отрицателни резултати, защото ако пробата е твърде разредена, тя няма да бъде положителна, ако титруването на антителата е твърде ниско (т.е. въпреки че има антитела, тестът не е положителен, тъй като концентрацията на специфични антитела срещу антигена, който е залепнал на дъното на ямката, не е достатъчна, за да даде откриваем сигнал).

Индиректният ELISA е методът на избор за откриване на наличието на серумни антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус. (VIH), причинителят на синдрома на придобита имунна недостатъчност (СПИН) .

Съгласно тази техника рекомбинантните протеини на обвивката на ХИВ и сърцевината се абсорбират като антигени в твърда фаза в ямките. ХИВ-инфектирани индивиди произвеждат серумни антитела срещу епитопи на тези вирусни протеини.

Като цяло индиректният ELISA може да открие серумни антитела срещу ХИВ още шест седмици след заразяването.

• Предлага висока чувствителност и гъвкавост, тъй като редица вторични антитела могат да се свържат с първично антитяло и един тип вторично антитяло може да маркира различни първични антитела.
• По-евтино е, тъй като са необходими по-малко белязани антитела.

• По-високо съотношение сигнал/шум.
• Отнема време и е трудоемък.

(Тест за улавяне на антиген и откриване на имунокомплекс).

Това е широко използван анализ, при който ямката е покрита с първо анти-антигенно антитяло. След отмиване на излишното антитяло се прилага тестовата проба, съдържаща антигена, който ще се задържи в ямката при разпознаване от първото антитяло.

След второ измиване, което отстранява незадържания материал, се прилага разтвор с второ белязано анти-антигенно антитяло.

По този начин всяка антигенна молекула ще бъде свързана с антитяло в основата, което я задържа, и поне едно второ антитяло, което я маркира. Този анализ има висока специфичност и чувствителност поради усилването на сигнала, разрешено от второто антитяло.

• Предлага висока чувствителност в сравнение с директния или индиректния ELISA
• Въвежда силно специфична реакция поради участието на две антитела за откриване на антигена.
• За откриване се използват както преки, така и непреки техники.

• Оптимизирането по отношение на антителата е проблематично поради проблеми с кръстосаната реактивност.
• За епитоп-специфично разпознаване могат да се прилагат само моноклонални антитела като съвпадащи двойки.
• Получаването на моноклонални антитела е досаден процес в случай на съвпадащи двойки и е по-скъпо от поликлоналните антитела.

Този тип ELISA е най-сложният. Използва се за откриване или количествено определяне на антигени, присъстващи в малки количества. Нарича се така, защото се използва референтен антиген, който ще се конкурира с антигена в пробата за свързване с антитялото. Опростената процедура би била следната:

1. Референтният антиген е имобилизиран върху плаката.
2. От друга страна, излишък от небелязано първично антитяло се инкубира с пробата, съдържаща интересуващия ни антиген, което води до образуването на комплекси антиген-антитяло.
3. Сместа антиген-антитяло се добавя към плаката, където референтният антиген ще се конкурира с антигена в пробата за свързване с антитялото.
4. Платото се измива, за да се отстранят разтворимите комплекси антиген-антитяло.
5. Към плаката се добавя ензимно белязано вторично антитяло, което ще се свърже с първичното антитяло, закотвено към референтния антиген.
6. Добавя се субстратът, който при реакция с ензима ще даде видим сигнал.

• Необходима е пренебрежимо малка обработка на проби и може да се приложи към необработени проби.
• По-малко чувствителен към експериментални грешки.
• Добра възпроизводимост и гъвкавост.

ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ) е широко използвано приложение за откриване и количествено определяне на протеини и антигени от различни проби. Специфичните за целта ELISA комплекти се предлагат от различни производители и могат да помогнат за рационализиране на вашите експерименти за имунооткриване.

Можете да прочетете много повече в нашия блог