Етикетирането на антитела или прикрепването на специфичен етикет към антитяло за подпомагане на откриването или изолирането/пречистването на протеин е важна техника. Белязаните антитела са от съществено значение за анализи, базирани на имунитета, като Western blots, los ELISA, поточна цитометрия, имунохистохимия (IHC) и имунофлуоресценция (IF). Белязаните антитела също се използват за изолиране и пречистване на един протеин от сложна смес от протеини. Антителата, подобно на други протеини, могат да бъдат маркирани с малки молекули, радиоизотопи, ензимни протеини и флуоресцентни багрила.

Какво е маркиране на антитела? Антитялото се свързва с антиген, за да инициира имунен отговор. Някои антитела се свързват със специфични антигени. Тази реакция формира основата на тестовете за идентификация. Такава реакция може да се наблюдава само под микроскоп с помощта на белязано антитяло.

Етикетът може да бъде ензим, флуорофор или колоидно злато. Ензимът може да предизвика хромогенна реакция, която прави идентификацията възможна. Флуоресцентната микроскопия се използва за преглед на флуорофорен етикет. Електронната микроскопия се използва за разглеждане на колоидно злато.

Маркирането на антитела може да се извърши по два метода: директно маркиране и индиректно маркиране. Както подсказва името, директното маркиране използва едно първично антитяло за процеса на маркиране. Това антитяло е ковалентно свързано с маркираща молекула. След това първичното антитяло се добавя към антигенния комплекс и се инкубира.

Първичното антитяло се свързва със специфичния антиген. Излишното антитяло се отмива. Свързването на етикета с първичното антитяло може да доведе до малка загуба на специфичност. Непрякото маркиране предизвиква две антитела. Първичното антитяло се използва за идентифициране и откриване.

Вторичното антитяло се използва за маркиране на антитяло и амплификация на етикета. Вторичните антитела също имат свойството да неспецифично се свързват с други молекули.

Етикетът е молекула, която подпомага идентифицирането на комплекса антиген-антитяло. За да изпълни тази задача, етикетът трябва да бъде ковалентно свързан с първичното или вторичното антитяло. Антитялото обикновено е протеинова молекула, която се състои от множество аминокиселини с лизинова верижна група. Цялата процедура за етикетиране е насочена към тази лизинова група, за да прикрепи етикета. Използват се четири вида ковалентни връзки. NHS връзката се образува в етикети, съдържащи тази активна странична верига.

В случай на етикети, които са протеини или ензими, за свързване се използва хетеробифункционален реагент. И антитялото, и етикетът съдържат много лизини. Следователно, една от протеиновите молекули е модифицирана, като има модифицирана активна група X, а другата протеинова молекула е модифицирана, като има активна група Y.

След това страничните вериги на модифицирания етикет и антитялото реагират, за да образуват белязаното антитяло. Карбодиимидни линкери се използват за етикети като багрило. Тези етикети съдържат карбоксилна група, която реагира с аминогрупата на антителата.

Радиоимунодиагностиката се практикува от 1988 г. Радиоизотопът се използва за маркиране при този подход. Има много използвани радиоизотопи. Изборът на изотоп варира в зависимост от приложението. Най-общо казано, антителата могат да бъдат класифицирани в четири типа въз основа на прицелното и фармакокинетичното действие.

Агонистични антитела, които имитират ендогенния лиганд и водят до сигнала за смърт. Блокиращи антитела, които свързват лиганда или модифицират рецептора. Антитела, които инициират ефекторни функции. Конюгирани антитела, които са конюгирани с цитотоксични вещества.

Изборът на радионуклид за маркиране на антитела зависи от целта и приложението. Следните свойства са в основата на избора на изотоп.

Фармакокинетиката на антитялото и полуживотът на радиоизотопа трябва да са еднакви.

Радиоизотопът трябва да излъчва фотони с енергия 120-200 keV за изобразяване.

Изотопите, които излъчват гама лъчение, се използват за изображения и терапия. За терапия се използват и изотопи, излъчващи алфа и бета радиация.

За радиомаркиране се използват халогени и метални катиони. Радиойодирането на протеини е реакция на електрофилно заместване. Радиомаркиращият агент е ковалентно свързан с тирозиновия остатък на протеиновата молекула. В случай на радиомаркиране с метален катион, антитялото трябва да бъде модифицирано от хелатиращ агент.

Пентетиновата киселина (DTPA, диетилентриаминпентаоцетна киселина) се използва като хелатиращ агент. Антителата запазват своята имунореактивност за една или две киселинни молекули от едно антитяло. При този метод трябва стриктно да се спазва съотношението киселина-протеин. Реактивността на антитялото намалява с увеличаване на съотношението киселина-антитяло.

Подготовка на антитела за маркиране: Антителата трябва да бъдат пречистени от серумна проба. Антителата се съхраняват при неутрално pH. Протеиновият разтвор се съхранява при 10 mg/mL.

Приготвяне на имуноконюгати: Смесете производното на лантаноловата киселина и разтвора на антитялото в съотношение 1:5. Ултрацентрофугирайте пробата и отстранете нереагиралата пантинова киселина.

Фиксиране на DTPA: Пригответе разтвор на антитяло при 5 mg/mL в натриев карбонатен буфер. Разтворете DTPA цикличен анхидрид в безводен диметилсулфоксид. Добавете 5 моларни еквивалента цикличен анхидрид към 1 mL от разтвора на антитялото. Оставете реакцията да протече при стайна температура в продължение на 2 часа. Ултрацентрофугирайте сместа, за да отстраните нереагиралата DTPA.

Радиомаркиране с итрий-90 или индий-111: Размразете подходящ обем от разтвор на антитяло-DTPA. Добавете желаното количество индиев хлорид/итриев хлорид и леко почукайте, за да се смеси. Оставете реакцията да протече при стайна температура за 1,5 часа. Прекратете реакцията чрез добавяне на DTPA към разтвора.

Ако искате да прочетете повече по темата, можете да посетите нашия блог

Характеристики на “Миши IFN-бета ELISA”

• Оптимизираните сдвоявания на антитела за улавяне и откриване с препоръчителните концентрации спестяват много време за разработка.
• Протоколите за разработка са осигурени за насочване на оптимизацията на пробния период.
• Тестът може да бъде съобразен с вашите специфични нужди
• Ефективна алтернатива на пълните комплекти

SOCS1 е член на семейството на STAT инхибитори (SSI), известни също като супресори на цитокиново сигнализиране (SOCS). Членовете на семейството на SSI са отрицателни регулатори на цитокиновото сигнализиране. SOCS1 функционира надолу по веригата на цитокиновите рецептори и участва в отрицателна обратна връзка за отслабване на цитокиновото сигнализиране.

Поликлоналните антитела се произвеждат чрез имунизиране на животни със синтетичен пептид, съответстващ на остатъците около Ala156 на човешки SOCS1. Антителата се пречистват чрез афинитетна хроматография на протеин А и пептиди.

Няколко доставчици предлагат анти-SLC1A5 антитела. Този ген кодира протеина “член 5 от семейство носители на разтворени вещества 1” при хора и може също да бъде известен като ASCT2, AAAT, ATBO, M7V1, транспортер на неутрални аминокиселини B(0) и ATB(0). Структурно протеинът има маса от 56,6 килодалтона. Въз основа на името на гена могат да бъдат намерени и ортолози на кучета, свине, маймуни, мишки и плъхове.