Изолиране на плазмиди

Изолиране на плазмиди

Въвеждането

Изолирането на плазмиди се състои от пет стъпки: клетъчен лизис, отстраняване на остатъците, утаяване на нуклеиновите киселини, изолиране на нуклеиновите киселини и ресуспендиране.

Плазмидният препарат е метод за извличане и пречистване на плазмидна ДНК. Разработени са много методи за пречистване на плазмидна ДНК от бактерии.

Тези методи неизменно включват три стъпки:

  • Растеж на бактериална култура
  • Събиране и лизиране на бактерии
  • Пречистване на плазмидна ДНК

Терминът “плазмид” е измислен от Джошуа Ледерберг през 1952 г. и изолирането на плазмид се основава на този термин. Плазмидите са елементи генетични екстрахромозоми, присъстващи в повечето видове Archae, Eukarya и Eubacteria.

Плазмидите са кръгли, двойноверижни ДНК молекули, които се различават от хромозомната ДНК на клетките.

Структурата и функцията на бактериалната клетка се ръководят от генетичния материал, съдържащ се в хромозомната ДНК. В някои случаи плазмидите обикновено не са съществени за оцеляването на бактерията гостоприемник.

Плазмидите допринасят за генетичното разнообразие и пластичността на бактериите. Те кодират функции, които може да не са определени от бактериална хромозомна ДНК.

Плазмидите определят черти, които позволяват на гостоприемника да продължи да съществува в иначе смъртоносни или ограничаващи растежа среди. Например антибиотична резистентност и протеинова експресия. Гените за резистентност към антибиотици често са кодирани от плазмида, което позволява на бактерията да продължи да съществува в среда, съдържаща антибиотици.

Това дава на бактериите конкурентно предимство пред чувствителните към антибиотици видове. В допълнение, като инструмент, плазмидите могат да бъдат модифицирани, за да експресират протеина, който представлява интерес (напр. производството на човешки инсулин с помощта на рекомбинантна ДНК технология).

Плазмидите са служили като безценни моделни системи за изследване на процеси като ДНК репликация, сегрегация, конюгация и еволюция. Плазмидите са централни за съвременната рекомбинантна ДНК технология като инструмент за генно клониране и като средство за генна експресия.

изолиране на плазмиди клетъчен лизис

Характеристики на плазмидите

Плазмидите, присъстващи в бактериите, се различават по своите физични свойства:

  • размера (kbp)
  • геометрията
  • броя на копията

Размер на плазмида

Размерът на плазмидите варира от 1 kbp (килобазова двойка) до 1000 (килобазова двойка) мега плазмиди, които имат много стотици базови двойки.

Геометрия на плазмида

Въпреки че повечето плазмиди имат кръгова геометрия, сега има много примери за плазмиди, които са линейни в различни бактерии.

Плазмидната ДНК може да се появи в една от петте конформации: Отворена кръгова ДНК с нарязани, която има отрязана една верига; отпусната кръгова ДНК, която е напълно непокътната с неразрязани и двете нишки, но е ензимно отпусната; линейна ДНК, която има свободни краища; свръхнавита ДНК, която е напълно непокътната и двете нишки не са разрязани; и денатурирана суперспирална ДНК, която е като суперспирална ДНК, но има несдвоени области, които я правят малко по-малко компактна.

Брой копия на плазмид

Броят на копията се отнася до средния или очакван брой копия на клетка гостоприемник. Плазмидите имат нисък, среден или висок брой копия. Да знаете към коя категория принадлежи плазмидът е много важно, когато започвате експеримент.

Ако работите с плазмид с нисък брой копия, който е свързан с нисък добив и следователно може да се наложи да настроите повече култури. От друга страна, ако се получи нисък добив с плазмид с голям брой копия, е необходимо отстраняване на проблема.

При бактериите с висок брой копия на плазмидите, по време на клетъчното делене плазмидите се сегрегират на случаен принцип в дъщерни клетки, докато при бактериите с нисък брой копия, по време на клетъчното делене и разделяне плазмидите се разделят по равно на дъщерни клетки.

Предимство на високия брой копия е повишената стабилност на плазмида, когато произволното разделяне (т.е. разделяне на плазмиди в дъщерни клетки) настъпва по време на клетъчното делене.

Плазмидна изолация

Изолирането на плазмидна ДНК от бактерии е решаваща техника в молекулярната биология и е съществена стъпка в много процедури като клониране, секвениране на ДНК, трансфекция и генна терапия. Тези манипулации изискват изолиране на плазмидна ДНК с висока чистота. Пречистената плазмидна ДНК може да се използва веднага във всички процедури на молекулярната биология, като смилане с рестрикционни ензими, клониране, PCR, трансфекция, in vitro транслация, блотиране и секвениране.

Алкалният лизис е метод, използван в молекулярната биология за изолиране на плазмидна ДНК или други клетъчни компоненти, като протеини, чрез разцепване на клетките. Бактериите, съдържащи плазмида, който представлява интерес, първо се култивират и след това се лизират с алкален лизисен буфер, състоящ се от детергент с натриев додецил сулфат (SDS) и силна основа на натриев хидроксид. Детергентът намалява фосфолипидния двоен слой на мембраната, а алкалът денатурира протеините, участващи в поддържането на структурата на клетъчната мембрана. Чрез серия от стъпки, включващи разклащане, утаяване, центрофугиране и отстраняване на супернатантата, клетъчните остатъци се отстраняват и плазмидът се изолира и пречиства.

Принцип

Пречистването на плазмидна ДНК от бактериална ДНК се основава на диференциална денатурация на хромозомна и плазмидна ДНК чрез алкален лизис за разделяне на двете.

Основните стъпки на изолиране на плазмид са разрушаване на клетъчната структура за създаване на лизат, отделяне на плазмида от хромозомната ДНК, клетъчни остатъци и друг неразтворим материал. Бактериите се лизират с лизисен буфер, съдържащ натриев додецил сулфат (SDS) и натриев хидроксид. По време на този етап повечето от клетките се разрушават, хромозомната и плазмидната ДНК се денатурират и полученият лизат се почиства чрез центрофугиране, филтриране или магнитно стрипинг. Последващата неутрализация с калиев ацетат позволява само ковалентно заключената плазмидна ДНК да се присъедини отново и да остане разтворена. Повечето от хромозомната ДНК и протеините се утаяват в комплекс, образуван с калий и SDS, който се отстранява чрез центрофугиране.

Бактериите се ресуспендират в буфер за ресуспендиране (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ml РНКаза А, pH 8,0) и след това се третират с 1% SDS (w/v) / алкален лизисен буфер (200 mM NaOH), за да се освободи плазмидна ДНК от клетките гостоприемници на Е. coli.

Неутрализиращият буфер (3,0 М калиев ацетат, рН 5,0) неутрализира получения лизат и създава условия, подходящи за свързване на плазмидна ДНК към колоната със силициева мембрана. Утаеният протеин, геномната ДНК и клетъчните остатъци се отделят чрез етап на центрофугиране и супернатантата се зарежда в колона.

Замърсявания като соли, метаболити и разтворими макромолекулни клетъчни компоненти се отстраняват чрез просто промиване с етанолов промивен буфер (1,0 М NaCl, 50 mM MOPS, рН 7,0, изопропанол (v/v) 15 %).

Чистата плазмидна ДНК накрая се елуира при условия на ниска йонна сила с леко алкален буфер (5 mM Tris/HCl, pH 8,5).

Медиите

Добивът и качеството на плазмидната ДНК силно зависят от вида на използваната хранителна среда. Повечето пречиствания на плазмиди са оптимизирани с култури върху стандартна среда Luria Bertani (LB).

За да приготвите LB среда, разтворете 10 g триптон, 5 g екстракт от дрожди и 10 g NaCl в 800 ml дестилирана вода. Коригирайте pH до 7,0 с 1 N NaOH. Регулирайте обема до 1 литър, като добавите дестилирана вода и автоклавирайте.

Клетъчната култура трябва да се инкубира при 37 °C с постоянно разклащане (200-250 rpm), за предпочитане в продължение на 12 до 16 часа през нощта. Обикновено може да се постигне OD от 3-6. Като алтернатива могат да се използват богати медии като 2 x YT (дрожди/триптон), TB (ужасяващ бульон) или CircleGrow.

Трябва също да се внимава, тъй като свръхрастежът на култура може да доведе до по-висок процент мъртви или гладни клетки и получената плазмидна ДНК може да бъде частично разградена или замърсена с хромозомна ДНК. За да се намерят оптималните условия за култивиране, културалната среда и времената на инкубация трябва да бъдат оптимизирани за всяка комбинация от щам гостоприемник/плазмиден конструкт поотделно.

Лизиране и неутрализация

Формулите за лизис могат да варират в зависимост от това дали се желае екстракция на ДНК/РНК/плазмид. Всички методи за бактериален лизис ще произведат плазмидни разтвори, замърсени с хромозомна ДНК и РНК. Центрофугирането премахва по-голямата част от хромозомната ДНК (тя ще образува пелета, докато плазмидната ДНК остава разтворима), а обработката с РНКаза ще отстрани замърсяващата РНК.

Като цяло, лизиращите буфери съдържат висока концентрация на хаотропни соли. Хаотропите имат две важни функции при извличането на нуклеинова киселина. Първо, те дестабилизират водородните връзки, силите на Ван дер Ваалс и хидрофобните взаимодействия, което води до дестабилизиране на протеини, включително нуклеази. Второ, те нарушават свързването на нуклеиновите киселини с водата, като по този начин осигуряват оптимални условия за прехвърлянето им в силициев диоксид.

Плазмидите се отделят и отстраняват от бактериалната клетка чрез ресуспендиране на 1-5 mL култура в ресуспендиращ буфер (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ml РНКаза А, рН 8.0) и пелетиране на клетките в микроцентрофуга при 11000 x g за 30 s. След това клетките се лизират чрез добавяне на 250 ug/ml културален буфер (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 ug/ml РНКаза А, рН 8.0).

Лизирането се постига чрез добавяне на 250 µl лизисен буфер с неутрализиращ буфер, тъй като подпомага пълното утаяване на SDS, протеини и геномна ДНК. Непълната неутрализация води до намаляване на добива. Въпреки това, освободената плазмидна ДНК е много уязвима в този момент и разклащането твърде много или твърде силно ще повреди ДНК.

Фиксиране и промиване върху силициева мембрана

След центрофугиране на лизата през силициева мембрана, желаните нуклеинови киселини трябва да бъдат свързани към колоната и примеси, като протеини и полизахариди, трябва да бъдат в потока.

В случай на растителни проби е вероятно те да съдържат полизахариди и пигменти, докато в случай на кръвни проби мембраната може да има леко кафяв или жълт цвят. Стъпките на измиване ще премахнат тези примеси. Обикновено има две стъпки на измиване, въпреки че това варира в зависимост от вида на пробата.

Първото измиване обикновено включва ниска концентрация на хаотропни соли за отстраняване на остатъчните протеини и пигменти. Това винаги е последвано от промиване с етанол за отстраняване на солите. Колоните съдържат силициева смола, която селективно свързва ДНК/РНК. ДНК, представляваща интерес, може да бъде изолирана благодарение на способността си да се свързва със силициев диоксид в присъствието на високи концентрации на хаотропни соли. Тези соли се отстраняват с промивка на алкохолна основа и ДНК се елуира с помощта на разтвор с ниска йонна сила като TE буфер или вода.

Свързването на ДНК със силициев диоксид изглежда се задвижва от дехидратация и образуване на водородни връзки, които се конкурират срещу слабото електростатично отблъскване. Следователно, висока концентрация на сол ще помогне за стимулиране на адсорбцията на ДНК върху силициев диоксид, а ниска концентрация ще освободи ДНК.

Елуиране

Обемът на елуиращия буфер и методът могат да бъдат адаптирани към приложението надолу по веригата, за да се постигне по-висок добив и/или концентрация от стандартния метод. Буферът за елуиране се използва за измиване на несвързани протеини в началото и при по-висока концентрация освобождава желания протеин от лиганда. Важно е елуиращият буфер да действа бързо, без да променя функцията или активността на желания протеин. За максимално елуиране на ДНК, оставете буфера да престои върху мембраната за няколко минути преди центрофугиране. Елуиращият буфер AE (5 mM Tris/HCl, pH 8,5) може да бъде заменен с TE буфер или вода. За предпочитане е да се използва слабо буфериран, леко алкален буфер, който не съдържа EDTA, особено ако плазмидната ДНК е предназначена за реакции на секвениране.

Аналитичен анализ на гела

Препоръчва се да се отстранят и запазят аликвотни части по време на процедурата по пречистване.

Ако плазмидната ДНК е с нисък добив или лошо качество, пробите могат да бъдат анализирани чрез електрофореза в агарозен гел, за да се определи на кой етап от процедурата на пречистване е възникнал проблемът.

Процедура

Съберете бактериални и ресуспендирани клетки

1. Изберете една колония от прясно разпръснато селективно блюдо и инокулирайте 2-5 ml стартерна култура от LB среда, съдържаща подходящия селективен антибиотик. Инкубирайте приблизително 8 часа при 37°C с енергично разклащане (приблизително 300 rpm).

2. Разредете закваската от 1/500 до 1/1000 в 3 ml селективна LB среда. Култивиране при 37°C за 12-16 часа с енергично разклащане (приблизително 300 rpm).

3. Съберете бактериални клетки чрез центрофугиране при 6000 x g за 15 минути и отстранете колкото е възможно повече от супернатантата. Ресуспендирайте бактериалната пелета в 0,1-0,5 ml буфер за ресуспендиране (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ml РНКаза А, pH 8,0). Бактериите трябва да бъдат напълно ресуспендирани чрез вортекс или пипетиране нагоре и надолу, докато не останат клетъчни бучки.

cel lysis

4. Добавете 0,25 ml лизисен буфер, разбъркайте добре чрез енергично обръщане на запечатаната епруветка 4-6 пъти и инкубирайте при стайна температура (15-25°C) за 5 минути. Не завихряйте, тъй като това ще доведе до срязване на геномната ДНК. Лизатът трябва да има вискозен вид. Не позволявайте реакцията на лизис да продължи повече от 5 минути.

Неутрализиране

5. Добавете 0,3 ml неутрализиращ буфер, разбъркайте незабавно и старателно чрез енергично обръщане 4-6 пъти и инкубирайте върху лед за 5 минути. Утаяването се засилва, ако се използва студен буфер за неутрализация и се инкубира върху лед. След добавяне на неутрализиращия буфер се образува бял, пухкав материал и лизатът става по-малко вискозен. Утаеният материал съдържа геномна ДНК, протеини, клетъчни остатъци и KDS. Лизатът трябва да се смеси старателно, за да се осигури равномерно утаяване на калиев додецил сулфат. Ако сместа все още изглежда вискозна, е необходимо допълнително смесване за пълно неутрализиране на разтвора. Хомогенна безцветна суспензия показва, че SDS наистина се е утаил.

Заредете лизата в колоната

6. Преди да заредите колоната, внимателно отстранете супернатантата и я прехвърлете в епруветка за събиране, съдържаща колоната, и центрофугирайте при 13 000 rpm за 1 минута.
7. Изхвърлете течащата течност и бързо отстранете супернатантата, съдържаща плазмидната ДНК. След центрофугиране супернатантата трябва да е бистра.
8. Ако супернатантата не е бистра, трябва да се извърши второ, по-кратко центрофугиране, за да се избегне нанасянето на суспендиран или прахов материал върху колоната. Суспендираният материал (който кара пробата да изглежда мътна) ще запуши колоната и ще намали или премахне потока.

Подвързване и пране

9. Добавете 0,7 ml промивен буфер към колоната, поставена в епруветката за събиране, и центрофугирайте за 10 минути при 13000 rpm за 1 минута. Уравновесете чрез прилагане на 1 ml буфер за еквилибриране (750 mM NaCl, 50 Mm MOPS, рН 7,0, 15 % изопропанол) и оставете колоната да се изпразни чрез гравитационен поток. Потокът на буфера ще започне автоматично чрез намаляване на повърхностното напрежение поради наличието на детергент в буфера за еквилибриране.
10. Нанесете супернатантата от стъпка 6 към колоната и я оставете да влезе в смолата чрез гравитационен поток.

Плазмидно елуиране

11. Елуирайте ДНК с 0,8 ml буфер за елуиране (1,23 M NAcL, 50 mm Tris-Cl, pH 8,5, 15%v изопропанол). Съберете елуата в 1,5 ml или 2 ml микроцентрофужна епруветка.
12. Утаете ДНК чрез добавяне на 0,7 обема (0,56 ml на 0,8 ml обем на елуиране) изопропанол при стайна температура към елуираната ДНК. Смесете и незабавно центрофугирайте при ≥10 000 rpm за 30 минути в микроцентрофуга. Внимателно декантирайте супернатантата. Всички разтвори трябва да са със стайна температура, за да се сведе до минимум утаяването на сол.
13. Промийте ДНК утайката с 1 ml 70% етанол и центрофугирайте при 10 000 rpm за 10 минути.
14. Внимателно прецедете супернатантата, без да нарушавате утайката.
15. 70% етанол премахва утаената сол и замества изопропанола с по-летливия етанол, което улеснява повторното разтваряне на ДНК.
16. Изсушете пелетата на въздух за 5-10 минути и разтворете повторно ДНК в подходящ обем буфер (напр. TE буфер, pH 8,0 или 10mM Tris-Cl, pH 8,5). Разтворете повторно ДНК пелетата, като изплакнете стените, за да възстановите цялото ДНК.

Определяне на производителността

За да се определи добивът, концентрацията на ДНК трябва да се определи както чрез UV спектрофотометрия при 260 nm, така и чрез количествен анализ върху агарозен гел. За да определите количествено концентрацията на нуклеинова киселина, разредете плазмидната ДНК 1:100 или 1:50 (в зависимост от броя на копията на плазмида) в ТЕ буфер и измерете абсорбцията (оптична плътност) при 260 nm (A260) и 280 nm (A280). Използвайте TE буфера като празен. Това измерване позволява директно изчисляване на концентрацията на нуклеинова киселина с помощта на формулата

[ДНК] (μg/mL) = A260 × Фактор на разреждане × 50

където 50 е коефициентът на екстинкция на ДНК. Съотношението A260/A280 дава разумна оценка за чистотата на препаратa

Прочетете много повече в нашия блог