Пречистването на плазмидна ДНК от бактериална ДНК се основава на диференциална денатурация на хромозомна и плазмидна ДНК чрез алкален лизис за разделяне на двете.
Основните стъпки на изолиране на плазмид са разрушаване на клетъчната структура за създаване на лизат, отделяне на плазмида от хромозомната ДНК, клетъчни остатъци и друг неразтворим материал. Бактериите се лизират с лизисен буфер, съдържащ натриев додецил сулфат (SDS) и натриев хидроксид. По време на този етап повечето от клетките се разрушават, хромозомната и плазмидната ДНК се денатурират и полученият лизат се почиства чрез центрофугиране, филтриране или магнитно стрипинг. Последващата неутрализация с калиев ацетат позволява само ковалентно заключената плазмидна ДНК да се присъедини отново и да остане разтворена. Повечето от хромозомната ДНК и протеините се утаяват в комплекс, образуван с калий и SDS, който се отстранява чрез центрофугиране.
Бактериите се ресуспендират в буфер за ресуспендиране (50 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 100 µg/ml РНКаза А, pH 8,0) и след това се третират с 1% SDS (w/v) / алкален лизисен буфер (200 mM NaOH), за да се освободи плазмидна ДНК от клетките гостоприемници на Е. coli.
Неутрализиращият буфер (3,0 М калиев ацетат, рН 5,0) неутрализира получения лизат и създава условия, подходящи за свързване на плазмидна ДНК към колоната със силициева мембрана. Утаеният протеин, геномната ДНК и клетъчните остатъци се отделят чрез етап на центрофугиране и супернатантата се зарежда в колона.
Замърсявания като соли, метаболити и разтворими макромолекулни клетъчни компоненти се отстраняват чрез просто промиване с етанолов промивен буфер (1,0 М NaCl, 50 mM MOPS, рН 7,0, изопропанол (v/v) 15 %).
Чистата плазмидна ДНК накрая се елуира при условия на ниска йонна сила с леко алкален буфер (5 mM Tris/HCl, pH 8,5).