Полимеразна верижна реакция (ASO-PCR)

Полимеразна верижна реакция (ASO-PCR)

Introduction

Алелно-специфичната олигонуклеотидна полимеразна верижна реакция (ASO-PCR) е алтернативен метод за откриване на мутации.

Предимството на ASO-PCR е, че това е бърз, прост и нерадиоактивен метод.

Все по-често се откриват много замени на единични базови двойки, които водят до наследствени заболявания, предразположеност към генетични разстройства и рак.

Възможността за амплифициране на специфични ДНК последователности чрез полимеразно-верижна реакция (PCR) направи възможно бързото и точно диагностициране на много наследствени болести.

Преди използването на PCR точковите мутации се идентифицираха чрез клониране и директно секвениране.

Също така Southern blotting и хибридизация с маркирани олигонуклеотидни сонди, центрирани върху мястото на мутацията, или смилане с рестрикционни ендонуклеази.

Тези методи бяха значително подобрени от PCR, който позволява амплифициране на ДНК фрагменти, съдържащи полиморфни участъци, от малки количества ДНК.

Въпреки това, тези техники обикновено отнемат много време, сложни са, изискват използването на радиоактивен маркер и, в случая на откриване на рестрикционна ендонуклеаза, са приложими само когато мутацията променя известно място на ексцизия.

Какво представлява ASO-PCR?

Алелно-специфичен олигонуклеотид (ASO) е къс участък от синтетичен ДНК материал, комплементарен на последователността на променлива целева ДНК.

Той действа като скрининг за наличието на мишената в теста Southern blot или, по-често, в по-простия тест dot blot. Това е широко разпространен инструмент, използван в генетичните тестове, криминалистиката и изследванията в областта на молекулярната биология.

ASO обикновено е олигонуклеотид с дължина 15-21 нуклеотидни бази. Той е проектиран (и използван) по начин, който го прави специфичен за една версия или алел на тестваната ДНК.

Дължината на ASO, избраната верига и условията, при които той се свързва с целевата ДНК (и се отмива от нея), играят роля за неговата специфичност.

Тези сонди обикновено могат да бъдат проектирани така, че да откриват разлика от едва 1 база в последователността на целевия ген – основна способност при анализа на единични нуклеотидни полиморфизми (SNP), важна за генотипирането и анализите на проекта “Човешки геном”.

За да бъде открит, след като се свърже с целта си, ASO трябва да бъде маркиран с радиоактивен, ензимен или флуоресцентен маркер.

Технологията на ASO се използва за откриване на разликата в базовите двойки (цитозин спрямо тимин), за да се измери метилирането в специфичен CpG сайт.

Какво означава ASO-PCR?

Алелно-специфичната олигонуклеотидна полимеразна верижна реакция (ASO PCR) е алтернативен метод за откриване на мутации, при който само идеално съчетаният олигонуклеотид може да действа като праймер за амплификация. Предимството на ASO-PCR е, че това е бърз, прост и нерадиоактивен метод.

ASO-PCR, известен също като система за амплификация на мутации (ARMS), е описан за първи път за откриване на мутации в гена α1-антитрипсин.

Оттогава тя е възприета при изследването на няколко гена, включително пренатална диагностика на муковисцидоза, полиморфизми на аполипопротеин Е и точкови мутации в онкогена ras.

При тази техника олигонуклеотидните праймери са проектирани така, че да са комплементарни на нормалната (див тип) или мутантната последователност, и двете се използват заедно с общ праймер.

Тъй като ДНК полимеразата не притежава 3′ екзонуклеазна активност, тя не е в състояние да поправи еднобазовото несъответствие между праймера и темплейта в 3′ края на ДНК праймерите.

Следователно, ако олигонуклеотидните праймери са проектирани така, че да съдържат несъответствия в близост до или в 3′ края, праймерът ще се разшири или не в зависимост от това кои алтернативни полиморфизми на една база са налице в целевата последователност.

Следователно при подходящи строги условия ще се амплифицира само целева ДНК, която е точно комплементарна на праймера.

Прост протокол за алелно-специфичен нуклеотиден PCR е показан по-долу.

Как работи?

Алелно-специфичната полимеразно-верижна реакция (ASPCR) е приложение на полимеразно-верижната реакция (PCR), което позволява директно откриване на всяка точкова мутация в човешка ДНК чрез анализ на PCR продукти върху агарозен или полиакриламиден гел, оцветен с етидиев бромид.

Пионер

Той е пионер в използването на синтетични олигонуклеотиди като специфични проби за вариации на последователности. генетика от Р. Брус Уолъс, работещ в Медицинския център на City of National Hope в Дуарте, Калифорния.

През 1979 г. Уолъс и неговите колеги съобщават за използването на ASO сонди за откриване на вариации в едноверижен бактериален вирус и впоследствие прилагат техниката за клониране на човешки гени.

През 1983 г. и 1985 г. лабораторията на Уолъс съобщава за откриване на мутация за сърповидно-клетъчна анемия в проби от “цяла геномна ДНК”, въпреки че това приложение е възпрепятствано от малкия брой етикети, които могат да бъдат пренесени от ASO.

За щастие PCR, метод за силно усилване на специфичен сегмент от ДНК, също беше докладван през 1985 г.

За по-малко от година PCR беше съчетан с ASO анализ. Тази комбинация реши проблема с маркирането на ASO, тъй като количеството на целевата ДНК може да бъде разширено спрямо вече съществуваща.

Също така, спецификата на самия PCR процес може да се добави към тази на ASO сондите, намалявайки проблема с фалшивото свързване на ASO с нецелеви последователности.

Комбинацията беше достатъчно специфична, за да може да се използва по прост начин на петно с точки, избягвайки трудоемкия и неефективен метод на южно бяло/черно петно.

PCR на базата на алел-специфичен олигонуклеотиден (ASO) тест

Ново секвениране на ДНК на поредица от риби идентифицира: единичен нуклеотиден полиморфизъм (SNP), съответстващ на два алела (A и B) на единичен ген (горен, среден).

Конструират се два PCR праймера, които са специфични съответно за SNP алели A и B.

Тези алел-специфични олигонуклеотиди (ASOs) са сдвоени с праймер за котва за ДНК последователност, обща за всички риби (горе, вдясно).

Прогресът на PCR се наблюдава в “реално време” и успешната реакция показва наличието на съответния SNP алел.

aso pcr

Приложение в аквакултурата

Рибовъд иска да знае дали някои от рибите (мъжките), използвани в експеримент с масово хвърляне на хайвер, допринасят непропорционално за генофонда на следващото поколение.

Тя избира две мъжки, които са хомозиготни за SNP A и B, съответно, и една немаркирана женска (горе, вляво).

Трите риби могат да хвърлят хайвера си на случаен принцип; Избрани са 48 ларви (долу вляво).

Тестовете ASO A и B се провеждат едновременно върху всички ларви във формат на плака с 96 ямки, в редуващи се редове (долу, вдясно).

Тук само 8 от 48-те ларви имат B алел, което показва петкратно репродуктивно предимство на A родителя.

Приложение на биоразнообразието

Ръководителят на риболова иска да знае съответното изобилие от рибни яйца от два различни вида с подобен размер, намерени в планктона.

Тя идентифицира регион, в който двата вида се различават по един SNP, произвеждайки съответно алели A и B (горе, вляво).

Конструирани са A- и B-специфични ASO (горе вдясно).

ДНК се извлича от всяка от 48-те яйцеклетки (долу вляво) и A и B ASOs се провеждат върху всяко яйце едновременно във формат на плака с 96 ямки, в редуващи се редове (долу вдясно).

Тук само 8 от 48-те ларви имат B алел, което показва петкратно изобилие на вида A спрямо вида B.

Този метод “RT-PCR ASO” е алтернатива на традиционното изискване за електрофоретични анализи и позволява бърз, широкомащабен скрининг на ларвни популации и кохорти.

Препратки

Studencki AB, Conner BJ, Impraim CC, Teplitz RL и Wallace RB “Дискриминация между човешки бета A, beta S и бета C глобинови гени с помощта на алел-специфични олигонуклеотидни хибридизационни сонди”. Am J Hum Genet vol. 37 (1), стр. 42-51 (1985).
^ a B Saiki, RK; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Horn GT; Erlich HA; Arnheim N (20 de diciembre de 1985). “Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for the diagnosis of sickle cell disease.”. Ciencias. 230 (4732): 1350–4. Bibcode:1985 Sci … 230.1350S. doi:10.1126 / science.2999980. PMID 2999980. Archivado desde el original el 19 de diciembre de 2008.
^ Wallace, RB; Shaffer, J; Murphy, RF; Bonner, J; Hirose, T; Itakura, K (1979). “Hibridación de oligodesoxirribonucleótidos sintéticos con ADN Phi-X 174: el efecto del desajuste de un solo par de bases”. Investigación de ácidos nucleicos. 6 (11): 3543–3558. doi:10.1093 / nar / 6.11.3543. PMC 327955. PMID 158748.
^ Conner BJ, Reyes AA, Morin C, Itakura K, Teplitz RL y Wallace RB “Detección del alelo de la beta S-globina de células falciformes por hibridación con oligonucleótidos sintéticos”. Proc Natl Acad Sci USA. vol. 80 (1), págs. 278-282 (1983).
^ Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB y Erlich HE “Análisis de ADN de beta-globina y HLA-DQ amplificado enzimáticamente con sondas de oligonucleótidos específicos de alelo” Nature vol. 324 (6093) págs. 163-166 (1986).