Southern Blotting Южно петно

Южно петно

Южно петно

Въведение

Southern Blotting или Южно петно Това е метод на Молекулярна биология, която открива наличието на определена ДНК последователност в сложна смес от тази нуклеинова киселина.

Southern blotting се използва в молекулярната биология за идентифициране на протеини и нуклеинови киселини и се използва широко за диагностични цели. Тази техника обездвижва интересуващата ни молекула върху носител, който е нитроцелулозна или найлонова мембрана.

Той използва хибридизационни техники за идентифициране на нуклеинови киселини и специфични гени. Техниката на блотиране е инструмент, използван при идентифицирането на биомолекули като ДНК, иРНК и протеини по време на различни етапи на генна експресия. Протеиновият синтез включва експресията на ДНК сегмент, който се превръща в иРНК, за да се получи съответният протеин. Молекули като ДНК, РНК и протеини се подлагат на биохимични анализи, които се разделят чрез блотинг техники.

В случай на клетка, тези молекули присъстват заедно и следователно, с помощта на блотирането, учените са в състояние да разпознаят конкретна молекула сред всички останали. Блотингът се извършва чрез преминаване на смес от представляващи интерес молекули през гел блок, който разделя молекулите според техния молекулен размер.

Така обработените молекули трябва да бъдат притиснати със сила към подходяща мембрана, която от своя страна ще прехвърли молекулите от гела към подходяща мембрана (найлон, нитроцелулоза или PVDF) чрез капилярно действие. След като молекулите са прехвърлени върху мембраната, тяхната позиция остава непроменена.

Southern blot е въведен от Edwin Southern през 1975 г. като метод за откриване на специфични ДНК последователности в ДНК проби.

Другите техники за блотиране, възникнали от този метод, са наречени Северна (за РНК), Западна (за протеини), Източна (за пост-транслационни модификации на протеини) и Югозападна (за ДНК-протеинови взаимодействия).

Блотиращите подтипове, като Northern, Western и Southern, зависят от целевата молекула, която се търси. Когато една ДНК последователност е основата или кодът за протеинова молекула, интересуващата ни ДНК молекула може да бъде подложена на Southern Blotting.

По време на генната експресия, когато ДНК се експресира като иРНК за производството на протеин, този процес може да бъде идентифициран чрез Northern blotting. И накрая, кодираната иРНК произвежда въпросния протеин, тази протеинова идентификация може да се извърши чрез Western blotting.

Техника на Southern Blotting

Методите за попиване се считат за помощно средство за гел електрофореза, която обикновено се прилага за разделяне на ДНК/РНК/протеини и дава възпроизводими резултати поради отличната си разделителна способност.

По този начин специфични молекули могат да бъдат открити сред комбинацията от молекули, подложени на разделяне. Повечето методи имат общ етап, при който молекулите, представляващи интерес, след като бъдат разделени, се прехвърлят от гела към твърда мембранна фаза, което се постига чрез накисване на разтвор през гела и мембраната с помощта на проникваща хартия. Много видове многостранни устройства също се предоставят от много доставчици за електроблотинг, което е по-специално полезно за трансфер, иницииран от по-малко порьозни полиакриламидни гелове в сравнение с често използваните порести агарозни гелове. В случай на ДНК и РНК, откриването на специфични последователности върху мембраната се извършва чрез хибридизация с маркирани с нуклеинова киселина сонди, което в случая на протеини се заменя с използването на маркирани с антитяло сонди.

Протоколите първоначално разработиха приложени радиоактивни сонди, маркирани с радиоактивни изотопи за откриване чрез прилагане на авторадиографски процедури. В този процес моделът на излъчени разпадни емисии на радиоактивен материал се използва за създаване на изображение върху рентгенов филм, което може да бъде достъпно и като цифрово изображение чрез прилагане на базирани на сцинтилация газови детектори или базирани на фосфоризация системи.

Като се имат предвид вредните ефекти от излагането на радиоактивност, са разработени други видове системи за етикетиране, които включват флуоресцентни и хемилуминесцентни реагенти. Базираните на луминесценция/флуоресценция методи се считат за чувствителни и без фон, като по този начин генерират по-точни резултати.

Освен това са въведени други модификации за разлика от оригиналния метод, като например прилагането на ДНК сонди вместо РНК, найлоновите мембрани са заменили традиционната нитроцелулоза и, за да се избегне ренатурирането на ДНК последователностите по време на трансфера, трансферът се извършва в алкален разтвор, докато в оригиналния протокол трябваше да се извърши в неутрален разтвор. ДНК се третира с киселина, за да се намали размерът й, за да се увеличи скоростта на трансфер на по-големите фрагменти.

Геловите ленти и тубусните гелове, приложени в оригиналния протокол, вече не се използват, а вместо тях се прилагат гел формати. Въпреки че има много промени в оригиналния протокол, настоящите протоколи запазват повечето от основните характеристики на оригиналния протокол.

Southern blotting е приложен в много важни проучвания , като например генетичното картографиране на човешкия геном, което се основава на откриването на полиморфизми на дължина на рестрикционни фрагменти чрез блотиране.

ДНК пръстовите отпечатъци също бяха разработени за първи път чрез хибридизиране на продуктите на рестрикционното смилане на човешка ДНК с минисателитни сонди. Повечето от основните приложения на този метод обаче вече са заменени от секвениране на ДНК и полимеразна верижна реакция (PCR), тъй като предоставят по-изчерпателни факти или данни и също така са лесни за прилагане.

Въпреки това блотирането все още се прилага в много области, като например измерване на броя на копията, анализ на дълги участъци от ДНК, които са трудни за амплифициране или секвениране чрез PCR или ДНК секвениране, и в случай на структурен анализ на ДНК, където физическите форми на ДНК се разделят чрез двуизмерна гел електрофореза и впоследствие се откриват чрез специфично за компонент блотиране.

Обща процедура за сушене

Хомогенизиране на проби, включващо пречистване на ДНК/РНК/протеин, което се извършва след екстракция от различни източници като клетки или тъкани.

Смилане на ДНК с рестрикционни ензими на фрагменти, което не е необходимо за РНК (northern blot).

Разделяне на интересуващата ни молекула чрез мембранна електрофореза обикновено върху агарозен гел за ДНК фрагменти. В случай на РНК проби, те могат да бъдат разделени върху агарозен гел в присъствието на формалдехид като денатуриращ агент. Това е необходимо, тъй като формалдехидът ограничава вторичните структури на РНК молекулите.

Прехвърлете молекулите (фрагменти ДНК/РНК) върху нитроцелулозна мембрана/найлонова мембрана от гела.

Прехибридизация (блокиране): Измиването на найлоновата мембрана с прехибридизиращ или блокиращ разтвор, включващ ДНК на сперма на сьомга, е необходимо за блокиране на неспецифични взаимодействия на ДНК и също така помага за намаляване на фоновия шум. Като алтернатива има някои налични в търговската мрежа блокиращи буфери, като буфер PerfectHyb™ Plus, където не се изисква ДНК на сьомга за блокиране.

Прясна ДНК, белязана с 32P алфа-белязан dCTP, се приготвя за подготовка на пробата.

Хибридизацията или идентификацията на молекулата се постига чрез инкубиране на петното със специфичната маркирана проба.

За откриване на сондата и интересната ДНК/РНК последователност, филмът се излага на -80°C.

Южно петно

Първата от тези разработени техники беше Southern blot, кръстена на д-р Едуин Саутърн, който я разработи за идентифициране на специфични ДНК последователности. Southern blotting е техника за откриване, използвана за намиране на целеви ДНК последователности в ДНК пробата в областта на молекулярната биология.

Процесът започва с електрофореза на ДНК молекули, които се хибридизират върху блотираща мембрана, последвана от етап на трансфер, при който ДНК от гела се прехвърля към блотиращата мембрана.

Исторически фон

Способността на ДНК веригите да се хибридизират произтича от тяхната допълваща природа, ясно представена в модела на Watson-Crick за структурата на ДНК. Първоначално бяха проведени експерименти за изследване на ренатурационния капацитет на ДНК и образуването на ДНК/РНК хибриди, за да се разбере специфичната за тъканта или клетката експресия.

По-късно хибридизацията навлезе на сцената с разработването на сонди, способни да откриват специфични последователности в мишената и имобилизирането на целевите последователности върху твърда подложка като нитроцелулозен прах, което по-късно доведе до нитроцелулозни мембрани.

Демонстрацията на Саутърн, че ДНК фрагменти, разделени чрез гел електрофореза, могат да бъдат прехвърлени към мембрана, позволява характеризирането на ДНК чрез хибридизационен модел и молекулни размери. По-късно този метод се прилага за пространствена идентификация на мишени и блотиране на бактериални колонии.

Етапът на електрофореза може да се извърши с помощта на два различни вида гелове, като полиакриламиден гел (PAGE) с урея и натриев додецилсулфатен гел (SDS) с урея. Тези два гела имат различно приложение. Когато се използва PAGE гел, същото количество ДНК фрагменти се прехвърлят върху попивателната хартия. Ако се използва SDS, разделителната способност на формираната лента остава същата.

При тази техника могат да бъдат идентифицирани ДНК молекули с размер 100 pg. Техниката може да се обобщи като образуване на двойноверижна ДНК, имаща една верига от целевата ДНК и другата от ДНК сондата. ДНК сондата се произвежда in vitro за интересуващата ни последователност.

Принцип

Рестрикционната ендонуклеаза, която е ензим, се използва за разграждане на ДНК на малки фрагменти. След това тези фрагменти се разделят чрез електрофореза. След това получените фрагменти се сортират според техния размер (kDa). След това ДНК фрагментите се прехвърлят върху попивателна хартия, където се инкубират със сонди.

Сондите, използвани в Southern blotting, могат да бъдат силно селективни. Те могат да се свързват селективно с разделителна способност 1 на милион и имат характеристиките да се свързват с предвидените целеви фрагменти.

Стъпки на Southern Blotting:

След това ще обсъдим стъпките на Southern blot, които трябва да следвате, за да откриете специфична ДНК последователност в кръвна или тъканна проба.

Стъпка 1: Екстракция на ДНК

ДНК може да бъде извлечена от почти всяка човешка тъкан. Възможните източници на ДНК на местопрестъплението включват кръв, сперма, тъкан от мъртва жертва, клетки от космени фоликули и слюнка. ДНК, извлечена от доказателства за престъпление („следи“ или биологични „следи“), се сравнява с ДНК, извлечена от референтни проби, получени от известни лица, обикновено кръв.

Стъпка 2: Дигестиране на ДНК с рестрикционна ендонуклеаза

ДНК, извлечена от пробата, се третира с рестрикционна ендонуклеаза, която е ензим, който разрязва двойноверижната ДНК там, където има характерна последователност. Най-често използваният ензим за легален анализ е HaeIII, който разрязва ДНК в последователността 5′-GGCC-3′.

Стъпка 3: Агарозна гел-електрофореза

След смилане на ДНК, получените ДНК фрагменти се разделят според техния размер чрез електрофореза върху агарозни гелове. По време на електрофорезата отрицателно заредените ДНК молекули мигрират към положителния електрод.

Тъй като молекулите на ДНК се движат напред, тяхната скорост на миграция се намалява от матрицата на агарозния гел. По-малките молекули се движат по-бързо през порите на гела, отколкото по-големите молекули.

В резултат на това има непрекъснато разделяне на ДНК фрагментите според техния размер, като по-малките фрагменти се движат на най-голямо разстояние от произхода или точката на приложение на пробата.

Стъпка 4: Изготвяне на Southern blot анализ

След електрофореза, отделените ДНК молекули се денатурират, докато остават върху агарозния гел, импрегнирайки го с алкален разтвор. След неутрализиране на алкалния разтвор, получената едноверижна ДНК се прехвърля върху повърхността на найлонова мембрана, правейки копие или „петно“.

Този процес на денатурация и трансфер е известен като метода на Саудърн в памет на неговия изобретател Едуард Саутърн. Точно както прилагането на попивателна машина върху намокрена с мастило хартия прехвърля реплика на изображението от хартията към попивателната машина, „проследяването“ на ДНК в гела до найлоновата мембрана запазва пространственото разпределение на ДНК фрагментите, постигнато в гела като резултат на електрофореза.

Стъпка 5: Хибридизация с радиоактивна сонда

Единична локусна проба е малка ДНК или РНК молекула, способна да хибридизира (т.е. да образува ДНК-ДНК или ДНК-РНК дуплекс) с ДНК на определен рестрикционен фрагмент в Southern blot анализа.

Образуването на дикатенарната молекула (дуплекс) зависи от комплементарното сдвояване на бази между последователностите на сондата и ДНК, присъстваща в „багрилото“. Пробите с единичен локус обикновено се маркират с радиоактивен изотоп за улесняване на откриването и се избират за откриване на полиморфен генетичен локус на единична човешка хромозома.

Southern blot, получен от стъпка 4, се инкубира в разтвор, съдържащ радиоактивна проба с единичен локус при условия на температура и концентрация на сол, които благоприятстват хибридизацията. След хибридизацията излишната несвързана проба се отмива, така че единствената радиоактивност, оставаща върху найлоновата мембрана, е тази, свързана с ДНК на целевия локус.

Стъпка 6: Откриване на RFLPs чрез авторадиография

Позициите на хибридизация на радиоактивната проба върху Southern blot мембраната се откриват чрез авторадиография. При тази техника найлоновата мембрана се поставя след измиване до рентгенов филм в кутия, която я изолира от светлина. Филмът записва позициите, където се случва радиоактивно разпадане. След експониране и фотографско проявяване, полученият запис на Южна хибридизация е известен като авторадиография.

Стъпка 7: Повторете резултата на Юга с допълнителни сонди

При правен ДНК анализ често се характеризират ДНК полиморфизми на няколко различни хромозоми. След разработването на авторадиограф за първата сонда, радиоактивността може да бъде отмита с разтвор с висока температура, който оставя ДНК на място, и хибридизирана с втора радиоактивна сонда, която се свързва с различен локус. Стъпки 5-7 се повтарят, като всеки път се открива различен локус. Групата от авторадиографи на същия Southern blot е известна като „ДНК профил“.”

Приложения на Southern Blot

Southern blotting се използва в няколко приложения. Основната употреба на Southern blotting е за идентифициране на специфична ДНК в ДНК проба. Използва се най-вече при идентифициране на вирусни и някои бактериални инфекции. В rDNA технологията Southern blotting се използва за изолиране на специфична ДНК.

Също полезно при изследване на мутации и генни пренареждания, това свойство се използва за диагностициране на неонатални заболявания и генетични заболявания. Поради точността на ДНК идентификацията, тази техника се използва при филогенетични изследвания, анализ на бащинство и майчинство, криминалистични изследвания и лична идентификация.

Southern blotting може да се приложи за изследване на структурата на ген или за изясняване на рестрикционни ензимни карти. По-специално, Southern blotting може да се използва при идентифицирането на метилирани места, присъстващи в случая на определени гени. Може да се приложи прилагането на рестрикционни нуклеази като MspI и HpaII, които могат както да идентифицират, така и да разрязват идентична последователност.

Откриването на RFLP от Southern Blot помогна да се картографират няколко генома, които бяха от решаващо значение. В областта на имунологията клоналните пренареждания на имуноглобулини, както и Т-клетъчни рецепторни гени, които играят важна роля в предизвикването на имунен отговор, могат да бъдат анализирани чрез Southern blotting.

Прочетете повече в нашия блог